Bakteri Tahan Asam (BTA)

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan diferensial lebih dari satu pewarna untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks yang tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam. Bakteri tahan asam memiliki kandungan senyawa dari peptidoglikan dan lipid kompleks (wax-D) yang disebut asam mycolat yang membangun struktur dinding selnya, sehingga menjadi impermeabel terhadap macam-macam prosedur pewarnaan termasuk pewarnaan Gram. Bakteri ini dikenal tahan asam sebab bakteri tersebut resisten terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam. Dalam prosedur pewarnaan tahan asam, Karbol fuchsin merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu melarutkan dinding sel. Pemanasan biasanya diperlukan untuk memperkuat penetrasi pewarna dasar ke dalam sel bakteri. Semua tipe sel akan tewarnai oleh pewarna dasar. Sel selanjutnya didekolorisasi oleh alkohol asam, yang mengilangkan pewarna dasar pada semua tipe sel bakteri, kecuali bakteri yang tahan asam. Metilin biru kemudian dijadikan pewarna lawan yang akan mewarnai sel yang telah terdekolorisasi. Akhir dari prosedur pewarnaan tahan asam akan menunjukkan warna merah – pink untuk bakteri tahan asam, dan warna biru untuk bakteri yang tidak tahan asam.

 Contoh bakteri tahan asam adalah Mycobacterium, sehingga teknik pewarnaan bakteri tahan asam (BTA) ini sering digunakan dalam identifikasi kuman penyebab infeksi paru.

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat warna karbol-fuchsin (fuchsin basa yang dilarutkan dalam suatu campuran phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol. Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau). Bakteri-bakteri tahan asam (spesies Mycobakterium dan beberapa Actinomycetes yang serumpun) berwarna merah dan yang lain-lain akan berwarna sesuai warna kontras.

Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu dinamakan basil tahan asam. Ciri-ciri khas Mycobakterium tuberculosis dalam jaringan adalah basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan filamen. Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom (misalnya auramin, rodamin).

Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl^-, SO₄^2-, CH₃COO^-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. 

 

1 Bakteri Tahan Asam

Penemuan dan penilaian bakteri tahan asam (BTA) secara mikroskopis, dilakukan menurut standar International Union Association Lung Tuberculosis Disease (IUALTD) sesuai dengan kesepakatan WHO (K.Toman 1971), sebelumnya belum ada standar sebagai acuan untuk mengetahui ketepatan hasil pemeriksaan BTA di laboratorium. Salah satu bahan yang digunakan untuk mendiagnosa adalah dahak atau sputum. Dahak yang diperiksa paling sedikit 3-5 cc. Jika jumlah kuman kurang dari 5000 dalam 1 cc dahak, maka itu tidak akan kelihatan di bawah mikroskop.

Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut :

• Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa saja ke poliklinik

• Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur.

• Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar dahak pagi tersebut

Ludah tidak dapat diperiksa karena ludah berasal dari kelenjar dalam rongga mulut. Biasanya dalam ludah tidak terdapat kuman TB.

Bakteri tahan asam (BTA) disebut asidofil (inggris: acidophile), adalah bakteri yang memiliki ciri-ciri berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri ini ada 41 spesies yang telah diakui oleh ICSB (International Committee on Systematic Bacteriology) yang sebagaian besar sudah saprofit dan sebagaian kecil lainnya patogen untuk manusia diantaranya Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leparae, Acidobacterium, Acidithiobacillales ferrooxidans, Acidithiobacillales thiooxidans, Thiobacillus prosperus, T. acidophilus, T. organovorus, T. cuprinus, Acetobacter aceti, bakteri yang digunakan dalam produksi asam cuka dari oksidasi etanol dan lain-lainnya yang dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan saprofit dikenal juga dengan nama atipik.

Bakteri ini membutuhkan bahan tambahan makanan seperti darah egg yolk, serum dan sel yang tebal yang terdiri dari asam lemak mivolet untuk pertumbuhannya. Mycobacterium tuberculose merupakan bakteri berbentuk batang sedikit bengkok, panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat 2 - 8 minggu, suhu optimal 37 - 38^oC. Mycobacterium tahan terhadap asam dan alkali dibanding dengan kuman lain sehingga apabila bahan spesimen mengandung kuman lain dapat dibunuh dengan mudah sehingga spesimen menjadi lebih murni.

Mycobacterium tuberculose terdapat pada manusia yang mengidap penyakit TBC dan penularannya terjadi melalui jalan pernafasan, tetapi spesies Mycobacterium bovis biasanya terdapat pada lembu dan dapat ditemukan pula pada manusia di usus.

 

Gambaran Bakteri Micobacterium tuberculosis di mikroskop (yang berwarna merah)

2. Pewarnaan Bakteri Tahan Asam

Fungsi pewarnaan tahan asam selain untuk mengetahui bentuk dan susunan sel bakteri juga untuk mengetahui sifat-sifat dari bakteri/physiologis dari bakteri (reaksi dinding sel bakteri).

Dari hasil pewarnaan bakteri tahan asam (BTA), bakteri tahan asam berwarna merah dan bakteri tak tahan asam berwarna biru karena pada bakteri tahan asam bersifat resisten terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam, sehingga warna dasarnya (Karbol fuchsin) tetap berwarna merah. Sedangkan bakteri tak tahan asam warna dasarnya terdekolorisasi oleh alkohol asam, sehingga warna dasarnya menjadi hilang dan ketika di tambahkan metilin biru akan berwarna biru.

Pemberian zat warna dasar pada pewarnaan bakteri tahan asam harus melalui proses pemanasan karena untuk memperkuat penetrasi pewarna dasar kedalam sel bakteri.

Manfaat pewarnaan bakteri tahan asam (BTA) dalam dunia kesehatan adalah untuk dapat menghasilkan antibiotik streptomisin, dapat menghasilkan vitamin B12, dan dapat menghasilkan vitamin K (membantu proses pembekuan darah).

Metode Pewarnaan BTA terbagi menjadi tiga, yaitu :

A.      Zeihl – Neelsen

Bahan :

·        Karbol Fuchsin

-         Basic Fuchsin 0,5 gr

-         Alkohol 95% 10 ml

-         Air Alkohol (5 gr fenol + 95 ml aquadest) 40 ml

·        Asam Alkohol

-         HCl pekat 5 ml

-         Alkohol 96% 90 ml

·        Methylen Blue

-         Methylen blue 0,3 gr

-         Alkohol 95% 30 ml

-         Aquadest 70 ml

Untuk larutan Methylene Blue, dapat diganti dengan :

-         Asam Pikrat 0,75 gr

-         Aquadest 100 ml

B.      Kinyon-Gabet (Than Tiam Hok)

Bahan :

·        Kinyon

-         Basic Fuchsin 4 gr

-         Kristal Fenol 8 gr

-         Alkohol 96% 20 ml

-         Aquadest ad 100 ml

·        Gabet

-         Methylen Blue 1 gr

-         H₂SO₄ 96% 20 ml

-         Alkohol 96% 30 ml

-         Aquadest 50 ml

C.      Fluorokrom

Pada pewarnaan fluorokrom,bakteri terwarnai sangat kontras dibanding latar belakangnya serta pemeriksaan dibawah mikroskop tidak memerlukan pembesaran sampai 100x.

Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, didapat bahwa Zeihl Neelsen merupakan metode terbaik dan dapat dilakukan di laboratorium sederhana.

3. Tujuan

a.Untuk mengetahui teknik pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA).
b.Mengetahui tingkat infeksi dari sputum.

4. Alat dan Bahan

- Mikroskop
- Lampu spirtus
- Kawat ose
- Objek glass
- Kapas alkohol
- Jembatan pewarnaan
- Sputum (dahak)
- Tissue
- Biakan bakteri 24-48 jam
- Karbol fuchsin
- Alkohol asam
- Methylen blue
- Oil imersi

5. Cara Kerja

a.      Preparat dibuat secara langsung kemudian difiksasi, yaitu dengan membersihkan kotoran dengan kapas alkohol pada objek glass

b.      Sputum diletakkan di atasnya dengan menggunakan kawat ose (dalam keadaan aseptis) setipis mungkin kemudian dilakukan pengeringan, setelah kering kemudian difiksasi.

c.      Objek glass yang kering ditetesi carbol fuchsin dan dipanaskan selama 5 menit tetapi jangan sampai mendidih.

d.      Cuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

e.      Tetesi dengan asam alkohol, lalu cuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

f.      Tetesi dengan methylen blue, diamkan selama 20 – 30 detik kemudian dicuci dengan menggunakan air mengalir, keringkan dan amati dibawah mikroskop.

g.      Tetesi dengan oil imersi mengamati dibawah mikroskop pada pembesaran 100 x.

h.      Gambar hasil pengamatan pada tabel pengamatan.

 

6. Pembahasan

Bakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 - 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan.

Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna.

Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum dengan menggunakan prosedur pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin, alkohol asam, dan methylen blue. Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu positif 1 dan positif 2 yang dilaporkan secara kuantitatif menurut IUAT, yaitu:
Negatif (-)             : apabila tidak ditemukan BTA.
Positif negatif (+/-) : apabila terdapat 1 – 9 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 1(+)             : apabila terdapat 10 – 90 BTA / 100 lapang pandang.
Positif 2(++)          : apabila terdapat 1 – 9 BTA / 1 lapang pandang.
Positif 3(+++)        : apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang.

Tujuan pemberian carbol fuchsin adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Tujuan pemberian alkohol asam adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak hilang. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna background.

Mewarnai bakteri yang tahan terhadap asam digunakan cara pewarnaan Ziehl Neelson. Pewarnaan Ziehl Neelson terdapat beberapa perlakuan dan zat kimia yang diberikan. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri. Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades atau air mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya.

 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

DAFTAR PUSTAKA

http://www.scribd.com/doc/31810329/PEWARNAAN-BAKTERI

http://rudyregobiz.wordpress.com/bakteri-gram-dan-pewarnaannya-2/

http://rustan-biologiofscience.blogspot.com/2009/08/teknik-pewarnaan-mikroorganisme.html

http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/

http://analiskesehatanmakassar.blogspot.com/2010/04/pewarnaan-bta-zeihl-neelsen.html

Pelczar,dan Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI-Press