A. Sejarah
Walaupun agak tidak terlalu jelas, kontribusi
kromatografi pada perkembangan kimia modern tidak dapat dipandang rendah. Tanpa
teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat
sukar , dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin.
Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail
Semënovich Tsvet, seorang ahli botani di Universiti Warsaw (1872-1919)
menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya
dituangkan campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara
mengejutkan, pigmen memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang
kolom. Ia menamakan kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Perkataan
kromatografi berasal daripada perkataan Yunani "warna" dan
"tulis". Kemudian kimiawan dari Swiss Richard Martin Willstätter
(1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk
menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada
kromatografi.
Tswett telah menerangkan resolusi klorofil dan
pigmen-pigmen lain yang diekstrak daripada tumbuhan dan diterangkan dalam
bentuk:
"Jika larutan klorofil
dalam petroleum eter dituras melalui satu lajur penjerap (saya menggunakan
kalsium karbonat, secara amnya, yang dipadatkan dalam satu tiub kaca yang
sempit), maka pigmen-pigmen akan terpisah dari atas hingga ke bawah dalam
beberapa zon yang berwarna mengikut jujukan jerapan, yang mana pigmen yang
lebih terjerap akan tersesar dengan perlahan berbanding dengan pigmen yang
kurang terjerap lalu memaksa pigmen-pigmen lain ke bawah. Pengasingan ini
adalah lengkap secara praktikal sekiranya satu zon pelarut yang tulen mengekori
sesuatu pigmen. Seperti spektrum cahaya, komponen yang berbeza dalam campuran
pigmen itu akan terpisah secara sistematik pada lajur kalsium karbonat dan
setiap pigmen boleh diidentifikasikan dan ditentukan kuantitinya. Saya
menamakan penyediaan sedemikian sebagai kromatogram dan kaedah itu dinamakan
kromatografi."
B. Teori
Kromatografi terbentuk apabila
terdapat satu fasa pegun dan satu fasa bergerak. Fasa pegun biasanya ialah
pepejal atau cecair manakala fasa bergerak biasanya ialah cecair atau gas.
Setiap molekul yang berbeza akan terjerap kepada fasa pegun dengan kekuatan
yang berbeza. Pada masa yang sama, dua molekul yang berlainan juga mempunyai
keterlarutan yang berbeza dalam fasa bergerak.
Katakan kita mempunyai
campuran dua bahan A dan B. A akan terjerap kepada fasa pegun dengan kuat
manakala B tidak. A juga mempunyai keterlarutan dalam fasa bergerak yang lebih
rendah berbanding dengan B. Jesteru, apabila campuran A dan B dibiarkan melalui
satu lajur kromatografi, B dapat bergerak dengan lebih cepat berbanding dengan
A kerana A mengalami rintangan yang kuat dalam perjalanannya.
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran
menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing
komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa
stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu
dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil).
Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom,
yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil
dan fasa diam (stationer).
Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer
dan fasa mobil dan kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada
jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang
terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih
lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe
molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.
C. Jenis Kromatografi
1.
Kromatografi
Cair (Liquid Chromatography)
Kromatografi cair merupakan teknik yang
tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika
larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul
didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda
dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange),
partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah
satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit
komponen tersebut melewati kolom. Terdapat beberapa
jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High
Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta
supercritical fluid chromatography
2. Reverse phase chromatography
Reverse phase chromatography merupakan
alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya
polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti
silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa
yang tidak mudah menguap (non-volatile).
3.
High
performance liquid chromatography
High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang
mirip dengan reverse phase. Hanya
saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang
digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat
menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.
4. Size exclusion chromatography
Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel
permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan protein. Metode
ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat
kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul
kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut
tidak dapat penetrasi pada pori-pori.
5.
Kromatografi
Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange
chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam
amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam
kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu
pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada
pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran
anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada
fase cair akan melewati kolom.
Jika muatan pada molekul sama dengan
kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul
tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik
dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan
penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan
metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah
serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses
keseluruhan.
D. Contoh Kromatografi
Beberapa contoh kromatografi yang sering
digunakan di laboratorium diberikan di bawah ini.
a.
Kromatografi partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat
dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat diterapkan pada sistem multikomponen
yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam kromatografi partisi, ekstraksi
terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat terlarut
didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam
banyak kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul
pelarut yang mengisi ruang antar partikel yang ter adsorbsi.
Contoh khas kromatografi partisi adalah
kromatografi kolom yang digunakan luas karena merupakan sangat efisien untuk
pemisahan senyawa organik.
Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan
seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya
diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari
atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil;
pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di
pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh
adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami
proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk
masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing
zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa
lapisan.
Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi
dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R
didefinisikan untuk tiap zat etralrut dengan persamaan berikut.
R = (jarak yang ditempuh zat terlarut) / (jarak
yang ditempuh pelarut/fasa mobil).
Gambar 12.3 Diagram skematik kromatografi
b.
Kromatografi kertas
Mekanisme pemisahan dengan kromatografi
kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam
kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan
dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah.
Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar
wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau
campuran zat-zat ini dapat digunakan.
Kromatografi kertas diterapkan untuk
analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki
sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah
menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling
sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan
kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence
Millington Synge (1914-1994) adalah orang pertama yang menggunakan metoda
analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat campuran asam amino menaiki
lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler, partisi asam amino
antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa
berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses
dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak
tertentu. Dari nilai R, masing-masing asam amino diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D)
menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses
secara dua dimensi dengan dua pelarut.
c.
Kromatografi gas
Campuran gas dapat dipisahkan dengan
kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat)
atau cairan (kromatografi gas-cair).
Umumnya, untuk kromatografi gas-padat,
sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi,
silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang
panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen
atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti
oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester
seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi,
silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam dan diisikan
ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa
disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas
(mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut
dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Metoda ini khususnya sangat baik untuk
analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester.
Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan
dengan teknik ini.
Efisiensi pemisahan ditentukan dengan
besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa
cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil
ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan
mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung
apakah tujuannya analisik atau preparatif.
d. HPLC
Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya
untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision
liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara
ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut
dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk
mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan
efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.
Silika gel atau oktadesilsilan yang
terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair
tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang
digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.
Kromatografi penukar ion menggunakan bahan
penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis
kation, anion dan ion organik.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
DAFTAR PUSTAKA
Tidak ada komentar:
Posting Komentar